Апоптоз, або запрограмована смерть клітини, являє собою процес, за допомогою якого внутрішні або зовнішні чинники, активуючи генетичну програму, призводять до загибелі клітини і її ефективному видаленню з тканини. Апоптоз - це механізм загибелі клітин, який має ряд біохімічних і морфологічних відмінностей від некрозу.
Апоптоз - це біохімічно специфічний тип загибелі клітки, який характеризується активацією нелізосомних ендогенних ендонуклеаз, які розщеплюють ядерну ДНК на маленькі фрагменти. Морфологічно апоптоз виявляється загибеллю одиничних, безладно розташованих клітин, що супроводжується формуванням округлих, оточених мембраною тілець («апоптотичні тільця»), які тут же фагоцитуються оточуючими клітинами.
Це енергозалежний процес, за допомогою якого віддаляються небажані і дефектні клітини організму. Він відіграє велику роль в морфогенезе і є механізмом постійного контролю розмірів органів. При зниженні апоптозу відбувається накопичення клітин, приклад - пухлинний ріст. При збільшенні апоптозу спостерігається прогресивне зменшення кількості клітин в тканині, приклад - атрофія.
Морфологічні прояви апоптозу
Апоптоз має свої відмінні морфологічні ознаки, як на світлооптичному, так і на ультраструктурному рівні. При забарвленні гематоксиліном і еозином апоптоз визначається в поодиноких клітинах або невеликих групах клітин. Апоптотичні клітини виглядають як округлі або овальні скупчення інтенсивно еозинофільної цитоплазми зі щільними фрагментами ядерного хроматину. Оскільки стиснення клітини і формування апоптотичних тілець відбувається швидко і також швидко вони фагоцитуються, розпадаються або викидаються в просвіт органа, то на гістологічних препаратах він виявляється у випадках його значної вираженості. До того ж апоптоз - на відміну від некрозу - ніколи не супроводжується запальною реакцією, що також ускладнює його гістологічне виявлення.
Найбільш чітко морфологічні ознаки виявляються при електронній мікроскопії. Для клітини, що піддається апоптозу характерно:
1. Стиснення клітини. Клітка зменшується в размерах- цитоплазма уплотняется- органели, які виглядають відносно нормальними, розташовуються більш компактно.
Передбачається, що порушення форми та обсягу клітини відбувається в результаті активації в апоптотичних клітинах трансглютамінази. Цей фермент викликає прогресивне утворення перехресних зв'язків у цитоплазматичних білках, що призводить до формування своєрідної оболонки під клітинною мембраною, подібно ороговевающим клітин епітелію.
2. Конденсація хроматину. Це найбільш характерний прояв апоптозу. Хроматин конденсується по периферії, під мембраною ядра, при цьому утворюються чітко окреслені щільні маси різної форми і розмірів. Ядро ж може розриватися на два або кілька фрагментів.
Механізм конденсації хроматину вивчений досить добре. Він обумовлений розщепленням ядерної ДНК в місцях, які зв'язують окремі нуклеосоми, що призводить до розвитку великої кількості фрагментів, в яких число пар основ ділиться на 180-200. При електрофорезі фрагменти дають характерну картину сходів. Ця картина відрізняється від такої при некрозі клітин, де довжина фрагментів ДНК варіює. Фрагментація ДНК в нуклеосоме відбувається під дією кальцій чутливої ендонуклеази. Ендонуклеаза в деяких клітинах знаходиться постійно (наприклад, в тимоцитах), де вона активується появою в цитоплазмі вільного кальцію, а в інших клітинах синтезується перед початком апоптозу. Однак ще не встановлено, яким чином після розщеплення ДНК ендонуклеазою відбувається конденсація хроматину.
3. Формування в цитоплазмі порожнин і апоптотичних тілець. У апоптотической клітці спочатку формуються глибокі впячивания поверхні з утворенням порожнин, що призводить до фрагментації клітини і формування оточених мембраною апоптотичних тілець, які складаються з цитоплазми і щільно розташованих органел, з або без фрагментів ядра.
Фагоцитоз апоптотичних клітин або тілець здійснюється оточуючими здоровими клітинами, або паренхіматозними, або макрофагами. Апоптотичні тільця швидко руйнуються в лізосомах, а навколишні клітини або мігрують, або діляться, щоб заповнити звільнене після загибелі клітини.
Фагоцитоз апоптотичних тілець макрофагами або іншими клітинами активується рецепторами на цих клітинах: вони захоплюють і поглинають апоптотичні клітини. Один з таких рецепторів на макрофагах - рецептор вітронектину, який є szlig-3-інтегринів і активує фагоцитоз апоптотичних нейтрофілів.
Апоптоз бере участь у наступних фізіологічних і патологічних процесах:
1. запрограмованого руйнуванні клітин під час ембріогенезу (включаючи імплантацію, органогенез). Незважаючи на те, що при ембріогенезі апоптоз не завжди є відображенням «запрограмованої смерті клітини», це визначення апоптозу широко використовують різні дослідники.
2. Гормон-залежної інволюції органів у дорослих, наприклад, відторгнення ендометрію під час менструального циклу, атрезії фолікулів в яєчниках в менопаузі і регресія молочної залози після припинення лактації.
3. Видаленні деяких клітин при проліферації клітинної популяції.
4. Загибелі окремих клітин в пухлинах, в основному при її регресії, але також і в активно зростаючої пухлини.
5. Загибелі клітин імунної системи, як В-, так і Т-лімфоцитів, після виснаження запасів цитокінів, а також загибелі аутореактівних Т-клітин при розвитку в тимусі.
6. Патологічною атрофії гормон-залежних органів, наприклад, атрофії передміхурової залози після кастрації і виснаженні лімфоцитів в тимусі при терапії глюкокортикоїдами.
7. Патологічною атрофії паренхіматозних органів після обтурації вивідних проток, що спостерігається в підшлунковій і слинних залозах, нирках.
8. Загибелі клітин, викликаних дією цитотоксичних Т-клітин, наприклад, при відторгненні трансплантата і хвороби «трансплантат проти хазяїна».
9. пошкоджених клітин при деяких вірусних захворюваннях, наприклад, при вірусному гепатиті, коли фрагменти апоптотичних клітин виявляються в печінці, як тільця Каунсільмена.
10. Загибелі клітин при дії різних факторів, які здатні викликати некроз, але діють в невеликих дозах, наприклад, при дії високої температури, іонізуючого випромінювання, протипухлинних препаратів.
Регуляція апоптозу
Апоптоз це генетично контрольована смерть клітини. В даний час виявлено велику кількість генів, які кодують речовини, необхідні для регуляції апоптозу. Багато з цих генів збереглися в ході еволюції - від круглих черв'яків до комах і ссавців. Деякі з них виявляються також в геномі вірусів. Таким чином, основні біохімічні процеси апоптозу в різних експериментальних системах (дослідження ведуться на круглих хробаків і мухах) є ідентичними, тому результати досліджень можна прямо переносити на інші системи (наприклад, організм людини).
Апоптоз може регулюватися:
- зовнішніми факторами;
- автономними механізмами.
Вплив зовнішніх факторів. Апоптоз може регулюватися дією багатьох зовнішніх факторів, які ведуть до пошкодження ДНК. При невідновні пошкодженні ДНК шляхом апоптозу відбувається елімінація потенційно небезпечних для організму клітин. У даному процесі велику роль відіграє ген супресії пухлин р53. До активації апоптозу також призводять вірусні інфекції, порушення регуляції клітинного росту, пошкодження клітини і втрата контакту з оточуючими або основною речовиною тканини. Апоптоз - це захист організму від персистенції пошкоджених клітин, які можуть виявитися потенційно небезпечними для багатоклітинного організму.
При стимуляції тканин яким-небудь мітогеном її клітини переходять в стан підвищеної мітотичної активності, яка обов'язково супроводжується деякою активацією апоптозу. Доля дочірніх клітин (виживуть вони чи піддадуться апоптозу) залежить від співвідношення активаторів та інгібіторів апоптозу:
інгібітори включають фактори росту, клітинний матрикс, статеві стероїди, деякі вірусні білки-
активатори включають нестачу факторів росту, втрату зв'язку з матриксом, глюкокортикоїди, деякі віруси, вільні радикали, іонізуючу радіацію.
При впливі активаторів або відсутності інгібіторів відбувається активація ендогенних протеаз і ендонуклеаз. Це призводить до руйнування цитоскелету, фрагментації ДНК і порушення функціонування мітохондрій. Клітка зморщується, але клітинна мембрана залишається інтактною, однак пошкодження її призводить до активації фагоцитозу. Загиблі клітини розпадаються на невеликі, оточені мембраною, фрагменти, які позначаються як апоптотичні тільця. Запальна реакція на апоптотичні клітини не виникає.
Автономний механізм апоптозу. При розвитку ембріона розрізняють три категорії автономного апоптозу: морфогенетичний, гистогенетический і филогенетический.
Морфогенетичний апоптоз бере участь у руйнуванні різних тканинних зачатків. Прикладами є:
- руйнування клітин в міжпальцевих проміжках;
- загибель клітин призводить до руйнування зайвого епітелію при злитті піднебінних відростків, коли формується тверде небо.
- загибель клітин в дорсальній частині нервової трубки під час змикання, що необхідно для досягнення єдності епітелію двох сторін нервової трубки і пов'язаної з ними мезодерми.
Порушення морфогенетичного апоптозу в цих трьох локалізаціях призводять до розвитку синдактилії, розщепленню твердого піднебіння і spina bifida відповідно.
Гістогенетичний апоптоз спостерігається при диференціюванні тканин і органів, що спостерігається, наприклад, при гормональнозавісімой диференціюванні статевих органів з тканинних зачатків. Так, у чоловіків клітинами Сертолі в яєчках плоду синтезується гормон, який викликає регресію проток Мюллера (з яких у жінок формуються маткові труби, матка і верхня частина піхви) шляхом апоптозу.
Філогенетичний апоптоз бере участь у видаленні рудиментарних структур у ембріона, наприклад, пронефроса.
При різних станах може спостерігатися як прискорення, так і сповільнення апоптозу. Незважаючи на те, що апоптоз можуть активувати різні фактори, характерні для певних типів клітин, однак кінцевий шлях апоптозу регулюється точно встановленими генами і є загальним, незалежно від причини активації апоптозу.
Всі фактори, що підсилюють або ослабляють апоптоз, можуть діяти прямо на механізм загибелі клітини, опосередковано, шляхом впливу на регуляцію транскрипції.
У деяких випадках вплив цих факторів на апоптоз є вирішальним (наприклад, при глюкокортикоид-залежному апоптозу тимоцитів), а в інших не має особливої важливості (наприклад, при Fas- і TNF-залежному апоптозу). У процесі регуляції бере участь велика кількість речовин. Найбільш вивченими з них є речовини з сімейства bcl-2.
Bcl-2 ген вперше був описаний як ген, який транслоціруется в клітинах фолікулярної лімфоми та інгібує апоптоз. При подальших дослідженнях виявилося, що Bcl-2 є мультігенних, який виявляється навіть у круглих черв'яків. Гомологічні гени були також виявлені в деяких вірусах. Всі речовини, що відносяться до даного класу діляться на активатори та інгібітори апоптозу.
До інгібіторів відносяться: bcl-2, bcl-xL, Mcl-1, bcl-w, аденовірусні E1B 19K, Епштейн-Барр-вірусний BHRF1. До активаторам відносяться bax, bak, Nbk / Bik1, Bad, bcl-xS.
Члени цього сімейства взаємодіють один з одним. Одним з рівнів регуляції апоптозу є взаємодія білок-білок. Білки сімейства bcl-2 формують як гомо- так і гетеродімери. Наприклад, bcl-2-інгібітори можуть утворити димери bcl-2-активаторами. Таким чином, життєздатність клітин залежить від співвідношення активаторів та інгібіторів апоптозу. Наприклад, bcl-2 взаємодіє з bax- при переважанні першого життєздатність клітини підвищується, при надлишку другого - зменшується. До того ж білки сімейства bcl-2 можуть взаємодіяти з білками, що не відносяться до цієї системи. Наприклад, bcl-2 може з'єднаються з R-ras, який активує апоптоз. Інший білок, Bag-1, посилює здатність bcl-2 інгібувати апоптоз.
В даний час прийнято вважати, що гени, що беруть участь в регуляції росту і розвитку пухлин (онкогени і гени-супресори пухлин), грають регулюючу роль в індукції апоптозу. До них відносяться:
- bcl-2 онкоген, який інгібує апоптоз, викликаний гормонами і цитокінами, що призводить до підвищення життєздатності клітини;
- білок bax (також з сімейства bcl-2) формує димери bax-bax, які посилюють дію активаторів апоптозу. Ставлення bcl-2 і bax визначає чутливість клітин до апоптотичних факторів і є «молекулярним перемикачі», який визначає, чи буде відбуватися зростання або атрофія тканини.
- c-myc онкоген, чий білковий продукт може стимулювати або апоптоз, або ріст клітин (при наявності інших сигналів виживання, наприклад, bcl-2)
- ген р53, який в нормі активує апоптоз, але при мутації або відсутності (що виявлено в деяких пухлинах) підвищує виживаність клітин. Встановлено, що р53 необхідний для апоптозу при пошкодженні клітини іонізуючим випромінюванням, однак при апоптозу, викликаному глюкокортикоїдами і при старінні, він не потрібний.
Зниження апоптозу
Продукт р53 гена стежить за цілісністю генома при мітозі. При порушенні цілісності геному клітина переключається на апоптоз. Навпаки, білок bcl-2 інгібує апоптоз. Таким чином, нестача р53 або надлишок bcl-2 призводить до накопичення клітин: ці порушення спостерігаються в різних пухлинах. Вивчення факторів регулюють апоптоз має важливе значення в розробці лікарських препаратів, що підсилюють загибель клітин злоякісних новоутворень.
Аутоімунні захворювання можуть відображати порушення в індукції апоптозу лімфоїдних клітин, здатних реагувати з власними антигенами. Наприклад, при системний червоний вовчак спостерігається порушення Fas-рецепторів на клітинній поверхні лімфоцитів, що веде до активації апоптозу. Деякі віруси підвищують свою виживаність шляхом інгібування апоптозу інфікованих клітин, наприклад, вірус Епштейна-Барра може впливати на обмін bcl-2.
Прискорення апоптозу
Прискорення апоптозу доведено при синдромі набутого імунодефіциту (СНІД), нейротрофічних захворюваннях і деяких захворюваннях крові, при яких спостерігається дефіцит яких-небудь формених елементів. При СНІД вірус імунодефіциту може активувати CD4 рецептор на неінфікованих Т-лімфоцитах, прискорюючи, таким чином, апоптоз, що призводить до виснаження клітин даного типу.
Значення апоптозу у розвитку організму і патологічних процесах
Апоптоз відіграє важливу роль у розвитку ссавців і в різних патологічних процесах. Функціонування bcl-2 потрібно для підтримки життєздатності лімфоцитів, меланоцитів, епітелію кишечника і клітин нирок під час розвитку ембріона. bcl-x необхідний для інгібування смерті клітин в ембріогенезі, особливо в нервовій системі. Bax необхідний для апоптозу тимоцитів і підтримки життєздатності сперматозоїдів під час їх розвитку. р53 є геном супресії пухлин, тому в ембріогенезі особливої ролі не грає, але обов'язково необхідний для супресії пухлинного росту. Миші, у яких були відсутні обидва р53 гена, виявляли надзвичайно високу схильність до розвитку злоякісних пухлин в результаті повного або часткового порушення апоптозу передпухлинних клітин. Посилений синтез білка, кодованого bcl-2 геном, призводить до пригнічення апоптозу і, відповідно, розвитку опухолей- даний феномен виявлений в клітинах В-клітинної фолікулярної лімфоми.
При лімфопроліферативних захворюваннях і схожою на системний червоний вовчак хвороби у мишей спостерігається порушення функції Fas-ліганда або Fas-рецептора. Підвищений синтез Fas-ліганда може попереджати відторгнення трансплантата. Апоптоз є частиною патологічного процесу при інфікуванні клітини аденовірусами, бакуловірусів, ВІЛ і вірусами грипу. Інгібування апоптозу спостерігається при персистуванні інфекції, в латентному періоді, а при посиленій реплікації аденовірусів, бакуловірусів, можливо герпесвирусов, вірусу Епштейн-Барра та ВІЛ спостерігається активація апоптозу, що сприяє широкому поширенню вірусу. При нейродистрофічних захворюваннях відзначається порушення функції гена (iap-гена), схожого з інгібітором апоптозу бакуловірусів.